Diffusione del virus respiratorio nel respiro espirato ed efficacia delle maschere facciali

risultati

Abbiamo esaminato 3.363 individui in due fasi di studio, alla fine arruolando 246 individui che hanno fornito campioni di respiro espirato (Extended Data Fig. 1 ). Tra questi 246 partecipanti, 122 (50%) partecipanti sono stati randomizzati a non indossare una maschera durante la prima raccolta del respiro espirato e 124 (50%) partecipanti sono stati randomizzati a indossare una maschera. Complessivamente, 49 (20%) hanno fornito volontariamente una seconda raccolta del respiro espirato di tipo alternativo.

Le infezioni di almeno un virus respiratorio sono state confermate mediante PCR a trascrizione inversa (RT – PCR) in 123 su 246 (50%) partecipanti. Di questi 123 partecipanti, 111 (90%) sono stati infettati da coronavirus umano (stagionale) ( n  = 17), virus influenzale ( n  = 43) o rinovirus ( n  = 54) (dati estesi, figure 1 e 2 ), incluso uno partecipante co-infetto da coronavirus e virus dell’influenza e altri due partecipanti co-infettati sia da rinovirus che da virus influenzale. Questi 111 partecipanti sono stati al centro delle nostre analisi.

Ci sono state alcune differenze minori nelle caratteristiche dei 111 partecipanti con i diversi virus (Tabella 1a ). Complessivamente, il 24% dei partecipanti aveva una febbre misurata ≥37,8 ° C, con i pazienti con influenza più del doppio delle probabilità rispetto ai pazienti con infezione da coronavirus e rinovirus di avere la febbre misurata. I partecipanti con infezione da coronavirus hanno tossito di più con una media di 17 (sd = 30) tosse durante la raccolta del respiro espirato di 30 minuti. I profili dei partecipanti randomizzati a gruppi con maschera contro gruppo senza maschera erano simili (Tabella Supplementare 1 ).
Tabella 1a Caratteristiche delle persone con infezione da coronavirus sintomatico, virus influenzale o rinovirus

Tabella a grandezza naturale

Abbiamo testato lo spargimento virale (in termini di copie virali per campione) in tamponi nasali, tamponi della gola, campioni di goccioline respiratorie e campioni di aerosol e confrontato questi ultimi due tra campioni raccolti con o senza maschera facciale (Fig. 1 ). In media, lo spargimento virale era maggiore nei tamponi nasali rispetto ai tamponi della gola per ciascuno di coronavirus ( copie mediane 8,1 log ₁₀ copie per campione contro 3,9), virus influenzale (6,7 contro 4,0) e rinovirus (6,8 contro 3,3), rispettivamente. L’RNA virale è stato identificato da goccioline respiratorie e aerosol per tutti e tre i virus, tra cui 30%, 26% e 28% di goccioline respiratorie e 40%, 35% e 56% di aerosol raccolti senza indossare una maschera facciale, da coronavirus, virus influenzale e partecipanti con infezione da rinovirus, rispettivamente (Tabella 1b). In particolare per il coronavirus, abbiamo identificato OC43 e HKU1 sia da goccioline respiratorie che da aerosol, ma abbiamo identificato solo NL63 da aerosol e non da goccioline respiratorie (Tabella Supplementare 2 e Dati estesi Fig. 3 ).
Fig. 1: Efficacia delle maschere chirurgiche nel ridurre la diffusione del virus respiratorio nelle goccioline respiratorie e negli aerosol degli individui sintomatici con infezione da coronavirus, virus influenzale o rinovirus.

a – c , copie di virus per campione raccolte in tampone nasale (rosso), tampone di gola (blu) e goccioline respiratorie raccolte per 30 minuti mentre non indossano (verde scuro) o indossano (verde chiaro) una maschera chirurgica e aerosol raccolti per 30 minuti mentre non indossa (marrone) o indossa (arancione) una maschera per il viso, raccolta da soggetti con sintomi respiratori acuti che erano positivi per coronavirus ( a ), virus dell’influenza ( b ) e rinovirus ( c ), come determinato da RT-PCR in qualsiasi campioni. Valori P per l’intervento maschera come predittore del registro ₁₀vengono mostrate copie di virus per campione in un modello di regressione Tobit univariato non rettificato che ha consentito la censura al limite inferiore di rilevazione del test RT – PCR, con differenze significative in grassetto. Per i tamponi nasali e i tamponi della gola, sono stati inclusi tutti gli individui infetti (coronavirus, n = 17; virus dell’influenza, n = 43; rinovirus, n = 54). Per le goccioline respiratorie e gli aerosol, il numero di individui infetti che hanno fornito campioni di respiro espirato mentre non indossavano o indossavano una maschera chirurgica, erano rispettivamente: coronavirus ( n = 10 e 11), virus dell’influenza ( n = 23 e 28) e rinovirus ( n= 36 e 32). Un sottogruppo di partecipanti ha fornito campioni di respiro espirato per entrambi gli interventi di maschera (coronavirus, n = 4; virus dell’influenza, n = 8; rinovirus, n = 14). I grafici a riquadri indicano la mediana con l’intervallo interquartile (cerniera inferiore e superiore) e ± 1,5 × intervallo interquartile dal primo e terzo quartile (vibrazione inferiore e superiore).

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Tabella 1b Efficacia delle maschere chirurgiche facciali nel ridurre la frequenza di rilevazione del virus respiratorio e la diffusione virale nelle goccioline respiratorie e negli aerosol di individui sintomatici con infezione da coronavirus, virus influenzale o rinovirus

Tabella a grandezza naturale

Abbiamo rilevato coronavirus in goccioline e aerosol respiratori in 3 su 10 (30%) e 4 su 10 (40%) dei campioni raccolti senza maschere facciali, rispettivamente, ma non abbiamo rilevato alcun virus in goccioline respiratorie o aerosol raccolti da partecipanti che indossavano il viso maschere, questa differenza era significativa negli aerosol e mostrava una tendenza alla riduzione del rilevamento nelle goccioline respiratorie (Tabella 1b ). Per il virus dell’influenza, abbiamo rilevato virus in 6 su 23 (26%) e 8 su 23 (35%) delle gocce respiratorie e dei campioni di aerosol raccolti senza maschere facciali, rispettivamente. C’è stata una riduzione significativa indossando le maschere per il viso a 1 su 27 (4%) nel rilevamento del virus dell’influenza nelle goccioline respiratorie, ma nessuna riduzione significativa nel rilevamento negli aerosol (Tabella 1b). Inoltre, tra gli otto partecipanti ai quali è stato rilevato il virus dell’influenza da RT-PCR da aerosol senza maschera, cinque sono stati testati mediante coltura virale e quattro erano positivi alla coltura. Tra i sei partecipanti a cui è stato rilevato il virus dell’influenza da RT-PCR da aerosol con maschera, quattro sono stati testati mediante coltura virale e due erano positivi alla coltura. Per il rinovirus, non vi sono state differenze significative tra il rilevamento di virus con o senza maschere facciali, sia nelle goccioline respiratorie che negli aerosol (Tabella 1b ). Le conclusioni erano simili nei confronti dello shedding virale (Tabella 1b ). Inoltre, abbiamo trovato una riduzione significativa dello shedding virale (Tabella Supplementare 2 ) nelle goccioline respiratorie per OC43 (Extended Data Fig. 4) e il virus dell’influenza B (Extended Data Fig. 5 ) e negli aerosol per NL63 (Extended Data Fig. 4 ).

Abbiamo identificato le correlazioni tra le cariche virali in diversi campioni (Extended Data Fig. 6 – 8 ) e alcune evidenze di declino del decadimento virale nel tempo dall’inizio del virus dell’influenza ma non del coronavirus o del rinovirus (Extended Data Fig. 9 ). Nelle analisi univariabili di fattori associati alla rilevazione di virus respiratori in vari tipi di campioni, non abbiamo identificato un’associazione significativa nella diffusione virale con giorni dall’esordio dei sintomi (Tabella Supplementare 3 ) per goccioline respiratorie o aerosol (Tabelle Supplementari 4 – 6 ).

Un sottogruppo di partecipanti (72 su 246, 29%) non ha tossito affatto durante almeno una raccolta espiratoria, di cui 37 su 147 (25%) durante l’assenza di maschera e 42 su 148 (28%) durante il raccolta del respiro maschera. Nel sottoinsieme per coronavirus ( n  = 4), non abbiamo rilevato alcun virus nelle goccioline respiratorie o negli aerosol di nessun partecipante. Nel sottoinsieme per il virus dell’influenza ( n  = 9), abbiamo rilevato virus negli aerosol ma non goccioline respiratorie da un partecipante. Nel sottoinsieme per il rinovirus ( n  = 17), abbiamo rilevato virus nelle goccioline respiratorie da tre partecipanti e abbiamo rilevato virus negli aerosol in cinque partecipanti.

Discussione

I nostri risultati indicano che la trasmissione di aerosol è una potenziale modalità di trasmissione per coronavirus, virus dell’influenza e rinovirus. Studi pubblicati hanno rilevato virus respiratori ^13 , 14 come l’influenza ^12 , 15 e il rinovirus ¹⁶ dal respiro espirato e il rilevamento di SARS-CoV ¹⁷ e MERS-CoV ¹⁸ da campioni di aria (senza frazionamento dimensionale) raccolti da ospedali in trattamento di pazienti con acuta grave sindrome respiratoria e sindrome respiratoria del Medio Oriente, ma la nostra dimostra la rilevazione di coronavirus umani stagionali nel respiro espirato, inclusa la rilevazione di OC43 e HKU1 da goccioline respiratorie e NL63, OC43 e HKU1 da aerosol.

I nostri risultati indicano che le maschere chirurgiche possono ridurre efficacemente l’emissione di particelle del virus dell’influenza nell’ambiente nelle goccioline respiratorie, ma non negli aerosol ¹² . Sia lo studio precedente che quello attuale hanno utilizzato un dispositivo di raccolta del bioaerosol, il Gesundheit-II (G-II) ^{12 , 15 , 19}, per catturare particelle di respiro espirato e differenziarle in due frazioni di dimensioni, dove le particelle grossolane di respiro espirato> 5 μm (goccioline respiratorie) sono state raccolte per impattazione con un dispositivo di simulazione del teflon inerziale a fessura da 5 μm e le particelle fini rimanenti ≤5 μm (aerosol) sono stati raccolti per condensazione in tampone. Abbiamo anche dimostrato l’efficacia delle maschere chirurgiche per ridurre il rilevamento di coronavirus e copie virali in grandi goccioline respiratorie e negli aerosol (Tabella 1b ). Ciò ha importanti implicazioni per il controllo di COVID-19, suggerendo che le maschere chirurgiche potrebbero essere utilizzate dai malati per ridurre la trasmissione in seguito.

Tra i campioni raccolti senza maschera, abbiamo scoperto che la maggior parte dei partecipanti con infezione da virus influenzale e coronavirus non ha rilasciato virus rilevabili in goccioline respiratorie o aerosol, mentre per il rinovirus abbiamo rilevato virus negli aerosol in 19 su 34 (56%) partecipanti (rispetto a 4 su 10 (40%) per l’influenza e 8 su 23 (35%) per coronavirus). Per coloro che hanno versato virus nelle goccioline respiratorie e negli aerosol, la carica virale in entrambi tendeva ad essere bassa (Fig. 1 ). Data l’elevata efficienza di raccolta del G-II (rif. ¹⁹ ) e dato che ogni raccolta del respiro espirato veniva condotta per 30 minuti, ciò potrebbe implicare che sarebbe necessario un contatto ravvicinato e prolungato per la trasmissione, anche se la trasmissione avveniva principalmente tramite aerosol , come è stato descritto per i raffreddori da rinovirus²⁰ . I nostri risultati indicano anche che potrebbe esserci una notevole eterogeneità nella contagiosità delle persone con infezione da coronavirus e virus dell’influenza.

La principale limitazione del nostro studio è stata la grande percentuale di partecipanti con spargimento virale non rilevabile nel respiro espirato per ciascuno dei virus studiati. Avremmo potuto aumentare la durata del campionamento oltre i 30 minuti per aumentare la diffusione virale catturata, a spese dell’accettabilità in alcuni partecipanti. Un approccio alternativo sarebbe quello di invitare i partecipanti a eseguire tosse forzata durante la raccolta del respiro espirato ¹². Tuttavia, lo scopo del nostro presente studio era di concentrarci sul recupero del virus respiratorio nel respiro espirato in una situazione di vita reale e ci aspettavamo che alcuni individui durante una malattia respiratoria acuta non tossissero molto o per niente. In effetti, abbiamo identificato l’RNA del virus in un piccolo numero di partecipanti che non tossivano affatto durante la raccolta del respiro espirato di 30 minuti, il che suggerirebbe che le vie di trasmissione di goccioline e aerosol sono possibili da individui senza segni o sintomi evidenti. Un’altra limitazione è che non abbiamo confermato l’infettività del coronavirus o del rinovirus rilevati nel respiro espirato. Mentre il G-II è stato progettato per preservare la vitalità dei virus negli aerosol e nel presente studio siamo stati in grado di identificare il virus dell’influenza infettiva negli aerosol,

metodi

Progettazione dello studio

I partecipanti sono stati reclutati tutto l’anno da marzo 2013 a maggio 2016 in una clinica ambulatoriale generale di un ospedale privato a Hong Kong. Come pratica di routine, il personale della clinica ha esaminato tutte le persone che frequentavano le cliniche per la respirazione e altri sintomi indipendentemente dallo scopo della visita al triage. Il personale dello studio si è quindi immediatamente avvicinato a coloro che hanno riportato almeno uno dei seguenti sintomi di ARI per ulteriori screening: febbre ≥37,8 ° C, tosse, mal di gola, naso che cola, mal di testa, mialgia e catarro. Le persone che hanno riportato ≥2 sintomi di ARI, entro 3 giorni dall’esordio della malattia e ≥11 anni avevano diritto a partecipare. Dopo aver spiegato lo studio e ottenuto il consenso informato dei partecipanti, un rapido test diagnostico per l’influenza, l’analizzatore di immunodosaggio fluorescente A + B di Sofia (cat. No. 20218, Quidel), è stato utilizzato per identificare l’infezione da virus A o B come incentivo a partecipare. Tutti i partecipanti hanno fornito un tampone nasale per il test rapido e un tampone nasale aggiuntivo e un tampone separato per la gola per la successiva conferma virologica in laboratorio. Tutti i partecipanti hanno anche completato un questionario per registrare informazioni di base tra cui età, sesso, gravità dei sintomi, farmaci, condizioni mediche e storia del fumo. Nella prima fase dello studio da marzo 2013 a febbraio 2014 (“Studio sull’influenza”), il risultato del test rapido è stato utilizzato per determinare l’idoneità per l’ulteriore partecipazione allo studio e la raccolta del respiro espirato, mentre nella seconda fase dello studio da marzo 2014 a maggio 2016 (“Studio sul virus respiratorio”), il test rapido non ha influito sull’ammissibilità.

Prima della raccolta del respiro espirato, ogni partecipante è stato assegnato in modo casuale in un rapporto 1: 1 a indossare una maschera chirurgica (cat. N. 62356, Kimberly-Clark) oppure no durante la raccolta. Per imitare la situazione della vita reale, sotto osservazione dello staff dello studio, ai partecipanti è stato chiesto di attaccare la maschera chirurgica, ma sono state fornite istruzioni su come indossare correttamente la maschera quando il partecipante ha indossato la maschera in modo errato. Ai partecipanti è stato chiesto di respirare normalmente durante la raccolta, ma è stata consentita la tosse (naturale) e il numero di tosse è stato registrato dal personale dello studio. I partecipanti sono stati quindi invitati a fornire un secondo campione di respiro espirato di tipo alternativo (ad esempio se il partecipante fosse stato inizialmente assegnato a indossare una maschera, avrebbero fornito un secondo campione senza maschera), ma la maggior parte dei partecipanti non ha accettato di rimanere per una seconda misurazione a causa di vincoli temporali. I partecipanti sono stati compensati per ogni raccolta di respiro espirato di 30 minuti con un coupon del supermercato del valore di circa US $ 30 e tutti i partecipanti hanno ricevuto un termometro timpanico del valore di circa US $ 20.

Approvazione etica

Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti di età ≥18 anni e il consenso informato scritto è stato ottenuto da genitori o tutori legali dei partecipanti di età compresa tra 11 e 17 anni oltre al proprio consenso informato scritto. Il protocollo di studio è stato approvato dal Consiglio di revisione istituzionale dell’Università di Hong Kong e dal Comitato di etica clinica e di ricerca dell’ospedale battista di Hong Kong.

Raccolta di tamponi e particelle di respiro espirato

I tamponi nasali e i tamponi alla gola sono stati raccolti separatamente, collocati nel mezzo di trasporto del virus, conservati e trasportati in laboratorio a 2-8 ° C e il mezzo di trasporto del virus è stato quotato e conservato a -70 ° C fino a ulteriori analisi. Le particelle di respiro espirato sono state catturate e differenziate in due frazioni di dimensioni, la frazione grossolana contenente particelle con diametro aerodinamico> 5 μm (qui denominato “goccioline respiratorie”), che includeva goccioline fino a circa 100 µm di diametro e la frazione fine con particelle ≤5 μm (qui denominato “aerosol”) dal dispositivo di raccolta del bioaerosol G-II ^{12 , 15 , 19}. Nel dispositivo G-II, le particelle grossolane del respiro espirato> 5 μm sono state raccolte da un dispositivo di simulazione del teflon inerziale a fessura da 5 μm e le particelle fini rimanenti ≤5 μm sono state condensate e raccolte in circa 170 ml di BSA / PBS allo 0,1%. Sia il dispositivo di simulazione che la condensa sono stati conservati e trasportati in laboratorio a 2-8 ° C. Il virus sul dispositivo di simulazione è stato recuperato in 1 ml e il condensato è stato concentrato in 2 ml di BSA / PBS allo 0,1%, aliquotato e conservato a -70 ° C fino a ulteriori analisi. In uno studio di validazione, il G-II è stato in grado di recuperare oltre l’85% di particelle fini di dimensioni> 0,05 µm e aveva un’efficienza di raccolta paragonabile del virus dell’influenza come il BioSampler SKC ¹⁹ .

Test di laboratorio

I campioni raccolti dai due studi sono stati testati contemporaneamente. I campioni di tampone nasale sono stati prima testati da un pannello virale per uso diagnostico, xTAG Respiratory Viral Panel (Abbott Molecular) per rilevare qualitativamente 12 virus respiratori e sottotipi comuni tra cui coronavirus (NL63, OC43, 229E e HKU1), influenza A (non specifica, H1 e H3) e virus B, virus respiratorio sinciziale, virus della parainfluenza (tipi 1-4), adenovirus, metapneumovirus umano e enterovirus / rinovirus. Dopo che uno o più virus respiratori candidati sono stati rilevati dal pannello virale dal tampone nasale, tutti i campioni dello stesso partecipante (tampone nasale, tampone della gola, goccioline respiratorie e aerosol) sono stati quindi testati con RT – PCR specifici per il candidato virus per la determinazione della concentrazione di virus nei campioni.²¹ , mentre la coltura virale non è stata eseguita per coronavirus e rinovirus.

analisi statistiche

L’outcome primario dello studio è stato il tasso di generazione del virus nella respirazione delle maree dei partecipanti infettati da diversi virus respiratori e l’efficacia delle maschere facciali nella prevenzione della diffusione del virus nell’espirazione espirata, considerando separatamente le goccioline respiratorie e gli aerosol. Gli esiti secondari erano la correlazione tra spargimento virale in tamponi nasali, tamponi alla gola, goccioline respiratorie e aerosol e fattori che influenzano lo spargimento virale in goccioline respiratorie e aerosol.

Abbiamo identificato tre gruppi di virus respiratori con la più alta frequenza di infezione identificata da RT-PCR, vale a dire coronavirus (compresi NL63, OC43, HKU1 e 229E), virus dell’influenza e rinovirus, per ulteriori analisi statistiche. Abbiamo definito lo spargimento virale come log ₁₀copie del virus per campione e diffusione virale tracciata in ciascun campione (tampone nasale, tampone della gola, goccioline respiratorie e aerosol); gli ultimi due sono stati stratificati per intervento della maschera. Come proxy dell’efficacia delle maschere facciali nella prevenzione della trasmissione di virus respiratori attraverso goccioline respiratorie e vie di aerosol, abbiamo confrontato la diffusione virale del virus respiratorio nelle goccioline respiratorie e i campioni di aerosol tra partecipanti che indossavano maschere facciali o no, confrontando la frequenza di rilevazione con un test esatto di Fisher su due lati e confrontando la carica virale (definita come log ₁₀copie di virus per campione) da un modello di regressione univariato non modificato di Tobit, che ha consentito la censura al limite inferiore di rilevazione del test RT – PCR. Abbiamo anche usato la regressione univariata non rettificata di Tobia per studiare i fattori che influenzano lo spargimento virale nelle goccioline respiratorie e negli aerosol senza l’uso di maschere, ad esempio l’età, i giorni dall’insorgenza dei sintomi, la precedente vaccinazione antinfluenzale, i farmaci attuali e il numero di tosse durante la raccolta del respiro espirato. Abbiamo studiato le correlazioni tra spargimento virale nel tampone nasale, tampone della gola, goccioline respiratorie e aerosol con grafici a dispersione e calcolato il coefficiente di correlazione del grado di Spearman tra due tipi di campioni. Abbiamo imputato 0,3 log ₁₀ copie di virus ml ⁻¹ per valori non rilevabili prima della trasformazione in log₁₀ copie di virus per campione. Tutte le analisi sono state condotte con R v. 3.6.0 (rif. ²² ) e il pacchetto VGAM v.1.1.1 (rif. ²³ ).