I ricercatori ricostruiscono rapidamente il virus SARS-CoV-2 utilizzando la genomica sintetica
Ricercatori in Svizzera e Germania hanno sviluppato una piattaforma di genomica sintetica basata su lieviti in grado di ricostruire rapidamente diversi virus RNA, tra cui la SARS-CoV-2.
La capacità di ricostruire i virus a partire da pezzi dei loro genomi ha permesso ai ricercatori di acquisire conoscenze sulla patogenesi virale e sullo sviluppo di vaccini, hanno scritto in uno studio pubblicato lunedì su Nature. Ma i grandi genomi dei virus RNA, come quelli dei coronavirus, sono ingombranti da clonare e manipolare in Escherichia coli perché sono troppo grandi e possono essere occasionalmente instabili.
Pertanto, in alternativa, hanno sviluppato una piattaforma genomica sintetica basata sui lieviti per ricostruire geneticamente i virus RNA, compresi i membri delle famiglie dei Coronaviridae, Flaviviridae e Paramyxoviridae.
Hanno generato frammenti subgenomici virali utilizzando isolati virali, DNA virale clonato, campioni clinici o DNA sintetico, che hanno riassemblato in un unico passaggio in Saccharomyces cerevisiae utilizzando la ricombinazione associata alla trasformazione (TAR) clonazione. Questa tecnica ha mantenuto ogni genoma virale come un lievito cromosoma artificiale (YAC).
“Sulla base di questa piattaforma siamo stati in grado di progettare e resuscitare i cloni chimicamente sintetizzati della recente epidemia di SARS-CoV-2 in una sola settimana dopo aver ricevuto i frammenti di DNA sintetico”, hanno scritto gli autori. “Il progresso tecnico che descriviamo qui permette una risposta rapida ai virus emergenti, poiché consente la generazione e la caratterizzazione funzionale di varianti di virus RNA in evoluzione, in tempo reale, durante un’epidemia”.
Durante la fase iniziale dell’epidemia di SARS-CoV-2, gli isolati del virus erano urgentemente necessari per sviluppare diagnostica, antivirali e vaccini e per stabilire modelli di malattia in vivo appropriati, ma non erano disponibili per le autorità sanitarie e la comunità scientifica, hanno detto i ricercatori. La generazione della SARS-CoV-2 da DNA sintetizzato chimicamente potrebbe aggirare la limitata disponibilità di isolati del virus e permetterebbe modifiche genetiche e la caratterizzazione funzionale.
I ricercatori hanno tentato per la prima volta un riassemblaggio a livello genomico del genoma di circa 1,1 megabase-lungo Mycoplasma usando l’E. coli come ospite intermedio, ma il mantenimento di frammenti di DNA di 100 kbp è stato difficile in questo ospite.
Sono poi passati a S. cerevisiae per clonare, assemblare e mutagenizzare l’intero genoma di Mycoplasma a causa della capacità del lievito di ricombinare i frammenti di DNA sovrapposti internamente, che ha portato allo sviluppo della tecnica di clonazione TAR.
Il team ha testato per la prima volta il ceppo A59 del virus dell’epatite dei topi (MHV) contenente il gene per la proteina fluorescente verde (MHV-GFP), che ha una consolidata piattaforma di genetica inversa basata sul virus della vaccinia.
L’RNA virale è stato preparato a partire da cellule murine infette da MHV-GFP e utilizzato per amplificare sette frammenti di DNA sovrapposti mediante RT-PCR. Tutti i frammenti di DNA sono stati trasformati simultaneamente in S. cerevisiae e i cloni risultanti sono stati sottoposti a screening per il corretto assemblaggio del YAC contenente il genoma MHV mediante PCR multiplex che copre le giunzioni tra i frammenti ricombinati.
Questo schermo ha rivelato che più del 90% dei cloni testati erano positivi, indicando un assemblaggio altamente efficiente nel lievito, hanno detto i ricercatori.
Hanno poi salvato MHV-GFP per generare RNA genomico virale incapsulato, lo hanno trasfuso in cellule BHK-MHV-N, e hanno trovato che le cellule che esprimono GFP erano facilmente rilevabili entro 48 ore, indicando il successo del recupero del virus infettivo. Infine, i ricercatori hanno valutato la cinetica di replicazione dei virus recuperati, che erano indistinguibili dal MHV-GFP parentale.
Per valutare se la piattaforma genomica sintetica poteva essere applicata ai coronavirus, e se poteva essere utilizzata per la mutagenesi rapida, i ricercatori hanno effettuato un esperimento simile utilizzando MERS-CoV, insieme a diversi altri coronavirus e virus di altre famiglie, come il virus Zika e il virus respiratorio-syncytial-virus umano. Sono stati in grado di clonare con successo questi genomi virali nel lievito indipendentemente dalla fonte del virus, dal modello di acido nucleico o dal numero di frammenti di DNA.
“Da notare che abbiamo clonato l’hRSV-B senza alcuna informazione preliminare sul genotipo del virus direttamente da un campione clinico (aspirato nasofaringeo), progettando i primer di consenso RSV per amplificare quattro frammenti di DNA sovrapposti”, hanno scritto gli autori. “Collettivamente, questi risultati dimostrano che la piattaforma genomica sintetica fornisce il progresso tecnico per generare rapidamente cloni molecolari di diversi virus RNA utilizzando come materiale di partenza gli isolati virali, il DNA clonato, il DNA sintetico o i campioni clinici”.
Uno dei principali vantaggi del sistema di clonazione TAR è che i genomi virali possono essere frammentati in almeno 19 pezzi sovrapposti e riassemblati con notevole efficacia.
